干货:实验室常用纯化方法荟萃

做新药仿制药研发过程中工艺占很大比重，做工艺较多的同学们都会遇到这样的问题，我好不容易把产品合成出来了，结果纯度达不到要求，一个纯化占据了大部分的研发时间，面对主管领导期盼的双眼、狰狞的面孔，恨不得能化身超体中的女神斯嘉丽进入分子位面用手抓出杂质扔进垃圾堆。说正事，常用的纯化主要分为重结晶纯化及其它纯化；其它纯化包含的内容比较多，比如打浆、过柱、吸附等。

1. 实验室最主要的是重结晶纯化操作

1.1冷却结晶：将待纯化产品加入某一溶剂中加热至溶清后再降温析晶的过程称为冷却结晶。

常说的冷却重结晶一般操作为将粗品与适当的溶剂加热至溶解，趁热过滤（如不需要除机械杂质则该步略去），降温析晶，过滤干燥。冷却结晶应该是大家使用最多的了，这一条中包含溶剂选择的原则相信同学们接触的也最多，我就少水点字数吧。

选择适宜的溶剂是重结晶的关键之一，适宜的试剂应符合下述条件：

• 与被提纯的化合物不起化学作用（这句是废话）。
• 化合物应易溶于热溶剂中，而在冷溶剂中几乎不溶；反向也有，没接触过。
• 对杂质的溶解度应很大或很小。
• 能得到较好的晶体，当然无定型也有，有时还得多加个转晶型过程。
• 溶剂的沸点适中。过低则溶解度改变不大，难分离，操作也困难；过高则溶剂不易除去造成溶剂残留超标。
• 单一溶剂优先，三类溶剂优先，操作安全优先（避免低闪点溶剂）。

在选择溶剂时应根据“相似相溶”的一般原理。溶质往往易溶于其结构相似的溶剂中。一般来说，极性的溶剂溶解极性的固体，非极性的溶剂溶解非极性的固体。在实验中往往要通过很多次实验才能确定使用哪一种溶剂（好像也是废话）。

一句话，重结晶溶剂的选择一般原则是对粗产品的热溶解度大，冷溶解度小，对杂质溶解性冷热都大或者冷热都小，产品在重结晶温度下稳定性要好；溶剂的沸点不宜过高或过低，主要利用产品与杂质在不同溶剂中溶解度的差异选择目标溶剂。

1.2反溶剂结晶：将待纯化产品用某一良溶剂溶解，再向其中加入不良溶剂析出产品的过程。

反溶剂结晶也称作抽提结晶，多用于制药行业。反溶剂结晶法是将良溶剂（也称为正溶剂）与不良溶剂(即反溶剂)结合使用，通过添加不良溶剂降低待结晶物在溶剂中的溶解度达到析晶纯化的目的。

反溶剂结晶有两个原则：①正反溶剂要相溶，②待重结晶物溶于正溶剂，不溶于或微溶于不良溶剂。

反溶剂结晶说起来简单轻松，但实际操作起来也挺复杂，一是正反溶剂的选择要经过大量筛选；二是正反溶剂的用量，良溶剂不能太多不然产品损失大，不良溶剂的量也很头疼，加多了没纯化效果，加少了损失又太大，还是要多做用量筛选。

1.先试：石油醚（正己烷）、乙醚、乙酸乙酯、乙醇、水，再试：丙酮、甲醇、乙腈、苯、氯仿、乙酸、吡啶等。如果还不行，就只好混合了。乙醚可以利用其（1）挥发性；（2）延玻璃向上爬而使固体析出的特性。丙酮如不与水配伍，应加以干燥。

2.混合溶剂法：用过量热的良溶剂溶解，过滤，加热，缓慢加入不良溶剂至有浑浊，加热至澄清。静置等待。。。

3.用分级结晶法。积累的母液过柱。

1）过柱预纯化，粗分离后再结晶；2）石油醚热提-冷析法；3）选低沸点的溶剂如乙醚；4）晶种的取得，用玻璃棒沾一滴溶液，挥干。5）不要轻易冷冻，用让溶剂自然挥发的方法。

关于用乙醚结晶。回流乙醚时，要加一冷凝管。不断从上口加乙醚，直至混浊消失，有时是因为溶解的较慢，而不是不能溶，所以要有耐心。如果加入很多乙醚还有少量沉淀不溶，则将其滤去，滤液浓缩至有固体析出，再加热，加入少量乙醚使澄清。自然放冷，可得晶型较好的结晶。过滤。用少量乙醚洗晶体。洗涤液合并入母液，在盛母液的瓶口蒙一层滤纸，或塞一团卫生纸，让乙醚自然挥发，而不能落入灰尘。每天早晨看一眼，直到有满意数量的晶体出来，别太贪了，挥发干了就又要重来了：）我曾经用此法成功拆分了左旋和右旋的生物碱。。“石油醚热提-冷却法”也是我用来对付油状物的方法，加入石油醚，沸腾，倾出上清液，底部油继续加入石油醚热提取，直至石油醚层无色，则基本提取完全。冷却后一般会析出晶体。

另外成油的一个原因是降温太快。

1.3蒸发结晶：将待纯化产品溶解后自然挥发或蒸除大部分溶剂以析出产品的过程。

蒸发结晶一般是待纯化物溶了后通过旋蒸或常压蒸馏去除大部分溶剂，过程中会优先析出纯度较高的产品，待剩余溶剂较少后直接抽滤，大部分杂质会随着母液一起分离。另外晶型研究中可用于单晶培养、无定型晶种制备等，就是把化合物溶清过滤后静置缓慢挥发。

2. 常用其他纯化操作

2.1打浆纯化

这个没什么说的，就是找到利用杂质和产品在某一溶剂中溶解度的不同进行打浆除杂，打浆操作一般以去除液体反应残留物料或难干燥溶剂较多。

2.2柱层析纯化

做新药及仿制药很少用到柱层析，原料药工艺非要过柱子可能也仅是过快速柱除杂的思路。不能否认柱层析的纯化效果，但是原料药项目如果使用柱层析纯化会消耗大量溶剂产生大量的废液，其生产成本太高。所以研究阶段应尽量避免柱层析，实在绕不过去最好能改用过快速柱法纯化。

2.3成盐及解离、更改盐形式纯化

将待纯化产品在溶解状态下成盐后再解离，或改变产品盐基用以去除大部分杂质的操作。

这一条手性拆分用的应该是最多的了。由于盐形式的变化会显著影响溶解度，因此这是另一种有用的结晶技术。举例来说，目标化合物可能在所选溶剂中溶解度低。但成盐后，它的溶解度显著变大并能完全溶解。冷却和反溶剂结晶都可以得到纯的目标化合物的盐。另一种情况是，目标化合物能溶解在所选溶剂中，而成盐后在此溶剂中的溶解度低。

2.4酸碱析晶纯化

将待纯化产品调酸碱后溶于水中，再反向调PH析出产品的过程。该方法对于易溶于水的杂质去除效果极佳。

2.5活性炭或硅胶或硅藻土吸附纯化

活性炭吸附、硅胶吸附除杂主要操作为将待纯化产品在某一溶剂中加热溶清后再加活性炭或硅胶，搅拌一定时间后趁热过滤，母液降温析晶即可。其中活性炭及硅胶的添加量一般是1-5%。该纯化法能去除吸附性较好的杂质，还能顺便脱个色。当然，如果硅胶或活性炭对产品的吸附性也很好，那收率就会降低好多。

硅藻土其主要成分与硅胶类似，常用于溶清待纯化产品抽滤前的铺垫。一般的操作为将待纯化产品溶清后，将硅藻土或硅胶铺垫于漏斗上再进行抽滤，其实说白了就是一个过快速短柱的办法，该方法对大极性杂质及钯等重金属的去除效果较好，至于其它杂质那得看它心情了。

2.6制备分离（正反相制备或HPLC制备）

制备分离一般是利用液相收集特定峰，常用于杂质研究过程。

这一条绝对是合成人员的最爱了，杂质研究过程中因为分离及合成的杂质量都比较少，要将杂质提纯最好的方法莫过于制备分离了，样品送给分析人员然后坐等杂质分离收集好岂不美滋滋。条件好的公司一般都会配备，没条件的？那只能手动过小柱子了。

2.7薄层色谱分离

一句话，刮小板或刮大板（你懂的），一般在杂质研究及制备中常用，毕竟一块大板最多也就涂20mg待分离产品。

2.8蒸馏和精馏操作

蒸馏是一种分离液体混合物的方法；精馏是多次简单蒸馏的组合。精馏是蒸馏的一部分，一般用于几个组分的分离，主要是异构体分离。其实吧可以简单点理解，有回流操作的蒸馏是精馏，没有回流的只是蒸馏。

说到蒸馏，真的是比过柱子纯化效果还好，可惜局限性太大。常用于油状中间体的纯化。

2.8干燥（鼓风、真空、冻干）

没错，干燥也是纯化的一种手段，有效的干燥方式能将溶剂残留控制在标准范围内，比较难以去除的溶剂如甲苯、乙腈等，其质量标准中限度都很低，烘干方式、温度、时长等都会对去除效果有很大影响，所以对干燥条件的考察也很重要。这段是水字数的，可以略过。什么？你说我为啥不写前面？我才不告诉你！